Ферменты и другие компоненты, участвующие в репликации, могут быть идентифицированы биохимически и генетически

Резюме видов деятельности, показанных на рисунке 5.7, предлагает несколько типов ферментов, которые можно ожидать в вилке репликации. Очевидно, что должна присутствовать по крайней мере одна ДНК-полимераза, но мы также ожидаем найти ферменты, которые раскручивают ДНК, инициируют сборку нуклеотидов и присоединяют фрагменты Окадзаки. Эксперименты, которые идентифицировали компоненты, необходимые для репликации, развивались по двум направлениям: биохимическое фракционирование и генетический анализ. Детальное понимание механизма синтеза в репликационной вилке исходило из обоих подходов, а также их мощной комбинации в технике, называемой in vitro дополнительности.

Биохимические методы

Биохимическая очистка требует анализа исследуемой активности, которая обычно является измерением продукта реакции, катализируемой ферментом. Поскольку реакция, катализируемая ДНК-полимеразами, является фундаментальной стадией репликации ДНК, мы рассмотрим ее в деталях. Довольно простой способ наблюдать активность ДНК – полимеразы, чтобы измерить включение радиоактивно меченый деоксирибонуклеозид или дезоксирибонуклеотида в ДНК веса полимера с высокой молекулярной. Последний может быть осажден сильной кислотой, такой как трихлоруксусная кислота, тогда как некорпоративные нуклеотиды или нуклеозиды не осаждаются. Например, сырой клеточный экстракт можно инкубировать с dTTP, меченным 32 P в а-фосфате (сокращенно [a32P] dTTP ) плюс другие немеченые нуклеозидтрифосфаты, соответствующие буферы и кофакторы. ДНК, синтезированную в этой реакции, может быть измерена как количество 32P, осажденное кислотой (рис. 5.9A).

ДНК-полимеразы могут быть отделены от других макромолекул в неочищенном клеточном экстракте с помощью нескольких этапов. Большинство (но не все) ферментов являются белками, а процедуры, используемые при очистке ферментов, в первую очередь являются методами разделения белков. Например, исследователь может отделить смесь белков от серии хроматографических колонок, чтобы отделить белки зарядом, затем по размеру, а затем по гидрофобности. Каждая фракция из хроматографической колонки анализируется для ДНК-полимеразы; цель состоит в том, чтобы отделить белки с желаемой активностью от как можно большего количества других белков с каждым столбцом (рис. 5.9B). Процедуры фракционирования продолжают до тех пор, пока фермент не будет очищен, что обычно означает, что только гель-электрофорез обнаруживает только один полипептид (или набор полипептидов для белка с несколькими субъединицами). В принципе, должно быть возможно выделить ферменты, которые могут выполнять любой процесс, для которого имеется надежный анализ. Однако несколько факторов могут затруднить такую ​​очистку, например, очень низкое содержание искомого белка в исходном материале или необходимость в проведении многосубъединительного комплекса для проведения реакции, особенно если такой комплекс не очень стабилен.

Многие ферменты, используемые при репликации, были выделены путем биохимического фракционирования. Они включают в себя не только ДНК-полимеразы, но и геликазы, которые разматывают родительский ДНК-дуплекс, чтобы создать два новых шаблона primase, которые катализируют начальное соединение нуклеотидов, чтобы начать цепочку ДНК, ДНК-лигазу, которая объединяет фрагменты ДНК и экзонуклеазы, которые могут быть использованы для удаления неправильно включенных нуклеотидов. Эти и другие ферменты использовались для восстановления стадий репликации ДНК в лаборатории, и описанные для этих ферментов активности используются для построения моделей того, как репликация может возникать в живых клетках. Критические тесты таких моделей могут быть сделаны с использованием генетических методов.

Генетические методы

Выделение и характеристика ферментов выявляет белки и РНК, способные катализировать реакции, и такие действия могут быть использованы для постулирования событий, происходящих в биологическом пути. Bi ° Химическое фракционирование и анализ являются богатыми источниками понимания химических реакций в клетках и клеточной физиологии. Однако такие результаты не обязательно говорят нам ли фермент очищали, используя свою способность катализировать реакцию в пробирке фактически используется, чтобы катализировать реакцию, что внутри клетки. Такой вывод лучше всего сделать с генетическими доказательствами.

Генетический анализ начинается с экрана или выбора для мутантов, которые являются дефектными в исследуемом процессе. Конечно, клетки, которые больше не способны синтезировать ДНК, не будут расти, поэтому мы должны изолировать условные мутанты. Вы должны вспомнить из главы 1, что продукт условной аллели сохраняет функцию в условиях разрешающей культуры (например, при низкой температуре, 33 ° C), но она теряет активность в условиях ограничительной культуры (например, при высокой температуре, 41 ° C). Другие условные мутанты могут быть чувствительны к холоду или чувствительны к солям. В случае синтеза ДНК условные мутанты перестают расти в ограничительном состоянии. Многие чувствительные к температуре мутанты, т. Е. Те, которые не растут при повышенной температуре, такой как 42 ° С, подвергали скринингу на способность синтезировать ДНК при ограничительной температуре. Такие термочувствительные мутанты в синтезе ДНК были названы ДНК мутанты.

Как только условные мутанты были выделены, их можно скрестить, чтобы определить, дополняют ли они ограничительную температуру. Результаты этого анализа позволяют мутантам быть помещены в группы комплементации, где каждая группа комплементации представляет собой ген, продукт которого необходим для синтеза ДНК в растущих клетках. Гены, представленные этими группами комплементации, называются dna гены, причем каждый другой ген имеет другую букву: dnaA, dnaB и т. д. Целью этого генетического подхода является выделение достаточно большого числа мутантов, так что по крайней мере один мутант получают в каждом гене, который необходим для интересующего процесса, в этом случае синтез ДНК. Если бы геном был фактически насыщен мутантами, число групп комплементации было бы близко к числу генов, кодирующих полипептиды, выполняющие исследуемый процесс. Исследования в E. coli раскрыли порядка двадцати ДНК Гены. Чтобы выяснить, какие белки и ферментативные активности кодируются каждым из этих генов, необходимо разработать метод для связывания генетически определенных генов с определенной биологической активностью. Это обсуждается в следующем разделе.

Сочетание генетических и биохимических методов

Метод выделения dna гены гарантируют, что их продукты необходимы для синтеза ДНК. Мы хотели бы точно знать, какая энзиматическая активность кодирует каждый ген. Для тех видов деятельности, для которых удобно in vitro анализ доступен, достаточно просто найти, какие мутанты являются дефектными в этих действиях в ограничительном состоянии. Однако некоторые гены dna могут кодировать белок с активностью, которая не ожидается или не будет легко проанализирована. Белки все еще могут быть выделены с использованием мощного подхода in vitro дополнение. Этот метод позволяет изолировать фермент просто из знания о том, что ген, необходимый для репликации, кодирует его. Вместо анализа на конкретную ферментативную активность один анализ способности экстракта или хроматографической фракции восстанавливать синтез ДНК в экстракте чувствительного к температуре dna- мутантом при ограничительной температуре.

Как показано на фиг. 5.10 А, клеточные экстракты dna мутанты не будут синтезировать ДНК при 41 o (ограничительная температура), но добавление экстракта клеток дикого типа приведет к восстановлению синтеза ДНК in vitro. это в пробирке комплементации анализ может быть использован для очистки белка из экстрактов дикого типа, опробование фракций из хроматографических колонок на способность дополнять выдержки из чувствительной к температуре (сокращенно ts ) (фиг.5.10 B). Многие из продуктов ДНА- гены были выделены с использованием этой методики.

Используя это знание основных методов идентификации ферментов, необходимых для репликации, мы перейдем к обсуждению каждого из основных. Мы подробно рассмотрим ДНК-полимеразы, тогда как другие ферменты будут обсуждаться менее тщательно.